PCSK9抑制剂多效性的研究进展

以低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高为特点的血脂异常是动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）重要的危险因素。一直以来，他汀类药物都是降LDL-C的药物基石，近年来前蛋白转换酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）抑制剂的出现开创了降脂治疗的新纪元。研究表明PCSK9抑制剂除了降脂以外还存在其他功效，本文就PCSK9抑制剂及其多效性的研究进展进行回顾。

一、PCSK9抑制剂：从基础科研到临床转化

1.PCSK9致病基因的发现：家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolamia，FH）是由于低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）介导的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）代谢相关基因发生致病性突变，导致LDL-C水平显著升高，动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）形成，从而引起一系列致残性和致死性心血管问题的疾病。FH是脂质代谢疾病中最严重的一种，根据其基因突变类型可分为杂合子型家族性高胆固醇血症（heterozygous familial hypercholesterolaemia，HeFH）和纯合子型家族性高胆固醇血症（homozygous familial hypercholesterolemia，HoFH）两类，其中HoFH患者极为罕见，患病率为1~3例/100万。PCSK9致病基因的发现即来自对传统降脂治疗无效的4个FH家系的治疗和随访研究。

2003年，Abifadel等首次揭示了PCSK9基因突变与常染色体显性FH的相关性。2008年，有研究进一步发现PCSK9失功能型突变可增强肝脏的脂质代谢能力，从而降低血LDL-C水平。类似地，PCSK9低表达突变（R46L）也被证实与人群中的低血LDL-C表型相关，而该人群的缺血性心脏病发病率相较于未携带该突变的人群降低了30%。上述发现提示PCSK9可以成为调节体内脂代谢、降低心血管疾病风险的重要可成药靶点。

2.PCSK9蛋白的致病机制：PCSK9是前蛋白转化酶枯草溶菌素家族的第9个成员，是由PCSK9基因编码的丝氨酸蛋白酶，在全身多种细胞中均有表达，主要在肝脏细胞中产生。PCSK9蛋白可参与LDLR的降解过程。生理状态下，细胞表面的LDLR结合血中游离LDL-C并介导其内吞进入细胞，在胞内进一步降解代谢，而LDLR则被运输回细胞膜进行循环利用。胞内升高的胆固醇浓度可上调PCSK9前体蛋白的表达水平。PCSK9前体蛋白在内质网中发生自发剪切，并分离为结合亚基和催化亚基，二者共同形成蛋白复合体并抑制催化亚基的酶活性，同时该复合体将被分泌至胞外。在细胞外，PCSK9分子通过催化亚基与LDLR结合，形成PCSK9-LDLR-LDL-C复合物，该复合物将被转运至溶酶体进行降解，从而阻断了LDLR返回细胞膜重新利用的过程。因此，在PCSK9基因功能获得性突变的FH患者体内，PCSK9的过度表达或过度激活会诱导细胞膜上的LDLR被快速内吞和降解，抑制细胞对LDL-C的清除，导致血液中LDL-C水平异常升高。

3.PCSK9抑制剂的研发与进展：中和或抑制PCSK9蛋白，阻断其介导的LDLR降解过程，上调细胞表面LDLR水平从而增强机体对LDL-C的代谢能力是新型降脂药物重要的研发思路。以PCSK9为靶点的在研抑制剂包括单克隆抗体、反义核苷酸类、小干扰RNA类、小分子抑制剂类等。其中PCSK9单克隆抗体（PCSK9 monoclonal antibody，PCSK9 mAb）是近年来生物医药领域中的研发热点，具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点。2018年《家族性高胆固醇血症筛查与诊治中国专家共识》建议对于经他汀联合依折麦布治疗后血脂仍不达标的FH患者加用PCSK9抑制剂。此外，2019年欧洲心脏病学会（European Society of Cardiology，ESC）血脂异常管理指南也指出对于ASCVD高危患者，若血脂在大剂量他汀及依折麦布联合治疗下仍控制欠佳，推荐联合使用PCSK9抑制剂进行二级预防。

二、PCSK9抑制剂具有多效性

1.血脂调控：靶向降解PCSK9，上调LDLR，从而降低机体血脂，是针对包括FH患者在内的心血管疾病患者的重要治疗手段。众多大型临床试验表明，PCSK9抑制剂能安全、有效地降低LDL-C水平，有效减少不良心血管事件。目前，两种PCSK9 mAb产品，依洛尤单抗和阿利西尤单抗已在国内上市。

依洛尤单抗已在多项临床试验中展示了其在亚洲人群的疗效和安全性，其中OSLER-1试验（针对LDL-C长期评估的开放标签研究）纳入1 255例使用依洛尤单抗的患者。随访5年发现，治疗后LDL-C平均水平从3.7 mmol/L减至1.6 mmol/L，且没有观察到中和抗体的产生。阿利西尤单抗的ODYSSEY OUTCOMES临床试验研究纳入18 924例近1年内发生过急性冠状动脉综合征的患者，与安慰剂组相比，阿利西尤单抗组LDL-C低54.7%，心血管不良事件发生率和全因死亡率均低15%。

此外，在研的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）药物Inclisiran也备受瞩目。Inclisiran可通过去唾液酸糖蛋白受体传递到肝细胞，其反义链通过与RNA结合诱导沉默复合物形成，从而特异性切割PCSK9的mRNA分子，降解PCSK9 mRNA并减少PCSK9蛋白合成。Inclisiran具有稳定性高、成本低、药效时间长等优点（皮下注射3个月后再次注射，此后每6个月1次）。在Inclisiran治疗HeFH患者的Orion-9试验以及治疗ASCVD患者的Orion-10试验中，历时17个月的随访结果也表明了其有效性，与安慰剂组相比，Inclisiran组的HeFH患者（n=242）LDL-C低41%，ASCVD患者（n=781）LDL-C低56%。

除了LDL-C外，PCSK9抑制剂也被报道与脂蛋白a［lipoprotein a，Lp（a）］的调控存在关联。Lp（a）是一种致AS的脂蛋白，目前针对Lp（a）的治疗方案相对较少，已有的方案包括使用烟酸及其衍生物、血液滤过等。而一项纳入27项随机临床试验的荟萃分析表明，PCSK9 mAb可显著降低循环Lp（a）水平（21.9%，95%CI：19.5%~24.3%），且Lp（a）基线水平越高，降幅越大，获益越多，这为降低Lp（a）提供了更多的可选方案。

2.改善炎症表型：PCSK9抑制剂通过强效降脂，可有效干预AS的核心机制，并在一定程度上干预AS炎症反应，进一步实现血管获益。目前已报道的PCSK9可能参与炎症反应的机制包括以下几个方面。（1）PCSK9可以促进炎性因子分泌：AS早期，在巨噬细胞等多种细胞的作用下，LDL-C可被氧化修饰转化为氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL），并参与调控多种细胞免疫反应，如炎症介质的分泌、血管平滑肌细胞迁移和增殖等。Tang等发现，PCSK9 siRNA可以通过对炎症反应相关转录因子的调控，如抑制核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-kB）的核转移，从而抑制小鼠体内ox-LDL诱导的炎症因子的分泌，包括白细胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）、IL-6和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α），从而发挥抗炎功能。在高脂饮食小鼠模型中，相较于野生型小鼠，PCSK9基因敲除小鼠形成的AS斑块体积以及内膜厚度均较低，斑块局灶的炎症因子水平也较低。

（2）PCSK9作用于细胞表面受体蛋白促进炎症反应：PCSK9被发现可通过促进载脂蛋白E受体2的降解而促进胆固醇在巨噬细胞中的积累，从而进一步促进NF-κB通路的激活及下游炎症因子的分泌。而清道夫受体（scavenger receptor，SR）家族的蛋白［如SR-A、CD36、凝集素样氧化低密度脂蛋白受体（lectin-like oxidation of low density lipoprotein receptors，LOX-1）］在结合并清除LDL-C及ox-LDL的过程中发挥着重要作用。PCSK9处理后的巨噬细胞表面SR-A、CD36以及LOX-1等受体表达上调，发挥出更强的脂蛋白吞噬能力，同时激活下游炎症相关通路，发挥促炎作用。

除了巨噬细胞，同样有证据表明在促炎性T细胞和树突状细胞中抑制PCSK9可消除ox-LDL介导的炎症反应，包括下调膜表面的共刺激分子（CD83、CD86和HLA-DR）和清道夫受体（LOX-1和CD36）的表达，以及抑制T细胞向Th1和Th17亚群的极化。

（3）PCSK9可以调控单核细胞介导的炎症反应：与野生型小鼠相比，在高表达PCSK9的高脂血症小鼠模型中，可在血管壁中检测到较高的单核细胞浸润（数量上升32%）。PCSK9 mAb处理后，血管壁的单核细胞浸润现象被抑制，同时细胞表面的趋化因子受体2［chemokine（C-C motif）receptor 2，CCR2］表达显著降低。一项基于FH患者的临床研究进一步印证了这一结论，HeFH患者单核细胞CCR2的表达水平与LDL-C正相关，单核细胞表面高CCR2水平会显著增强其迁移能力并使其更多地积聚于动脉壁。PCSK9 mAb治疗可在降低LDL-C的同时下调单核细胞表面CCR2水平。

综上，目前已有大量的细胞和动物实验数据支持PCSK9与炎症反应的关联性，但相应的临床数据相对缺乏。PCSK9 mAb治疗的抗炎作用仍未在高证据质量的临床试验中获得证实，PCSK9 mAb也未在临床试验中表现出降低超敏C反应蛋白的效果。目前已有的证据仍主要提示PCSK9 mAb通过大幅降低患者的LDL-C实现抗炎效果。

3.抗动脉和静脉血栓形成：除血脂外，凝血状况也是急性冠状动脉综合征的影响因素。2017年，Navarese等纳入333例接受替格瑞洛或普拉格雷治疗后进行经皮冠状动脉介入治疗的患者，发现PCSK9浓度更高的患者，其血小板在二磷酸腺苷激活后可发生更强的凝聚反应，并且在1年的随访中有更高的主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）发生率（HR=2.61）。这也是最早的在急性冠状动脉综合征患者中指出PCSK9与血小板存在关联性的报道。（1）PCSK9与动脉血栓的关系：血小板作为外周血中一类重要无核血细胞参与了人体众多生理、病理及药理过程。2020年，Barale等对高胆固醇血症患者给予PCSK9 mAb治疗并进行了为期12个月的随访，观测到血小板活性显著下降且对阿司匹林的反应性增强。这些患者的P选择素以及血小板因子4等反映血小板功能的因子水平出现显著下降，并且始终与LDL-C和PCSK9水平存在显著关联性，提示PCSK9 mAb降血脂的能力及中和PCSK9的效果均与血小板功能相关。

除了PCSK9在不同人群中与MACE及血小板活化相关指标的关联性研究以外，PCSK9与血小板之间的直接相互作用关系也得到了验证。在体外实验中，PCSK9蛋白刺激后，人和小鼠来源的血小板均可观测到活化反应性显著提升，表现为在受到激动剂激活后，其P选择素及糖蛋白Ⅱb/Ⅲa等血小板直接相互作用指标会进一步升高。使用氯化铁刺激PCSK9敲除的颈动脉损伤小鼠模型，与野生型小鼠相比，其形成动脉血栓的时间更长，且形成的血栓体积也更小。

（2）PCSK9与静脉血栓的关系：一项纳入FOURIER和ODYSSEY研究的荟萃分析发现，PCSK9抑制剂可显著降低静脉血栓栓塞风险（HR=0.69，95%CI：0.53~0.90，P=0.007），且基线LDL-C水平与静脉血栓栓塞风险降低幅度之间没有关系，提示Lp（a）的下降可能是这种作用的重要媒介。此外，在下腔静脉结扎术构建的静脉血栓小鼠模型中，与野生型相比，PCSK9基因敲除的小鼠静脉血栓较小，且游离P选择素水平较低，提示PCSK9可直接影响血小板功能，进而解释PCSK9基因敲除小鼠中静脉血栓形成能力的下降。

值得注意的是，与静脉血栓形成密切相关的凝血因子Ⅷ在血液中的主要清除途径是通过LDLR。二者的水平均受PCSK9调控，这可能是PCSK9调控静脉血栓的机制之一，但目前尚无研究证明PCSK9与凝血因子Ⅷ的关系，PCSK9与静脉血栓风险的关联还有待更多研究证实。

（3）PCSK9与凝血相关的机制探究：PCSK9对凝血机制的影响主要通过血小板，目前已经有多方面的相关机制的报道。一方面，PCSK9可直接作用于血小板表面相关分子从而调节血小板功能，如CD36等。CD36是B类清道夫受体家族中的一员，其主要功能之一是结合LDL-C及ox-LDL，介导其清除并激活相应的下游信号通路。近期发表的研究指出PCSK9可以直接与血小板表面的CD36受体结合，激活下游的酪氨酸激酶、细胞外信号调节激酶5及氨基末端激酶通路，进而增加活性氧的产生并激活环氧化酶1、血栓素A2通路，最终促进血小板的活化。PCSK9 mAb治疗可通过中和PCSK9而显著抑制血小板的过度活化。另一方面，PCSK9对于机体血脂及炎症状态起着重要的调节作用，PCSK9引起的相关血脂异常及炎症反应也都对高凝状态起着促进作用。除CD36外，血小板表面也表达LOX-1。PCSK9与CD36及LOX-1结合并抓获血液中的LDL-C及ox-LDL后，血小板中细胞外信号调节激酶5通路等被激活，诱导血小板的活化。而炎症因子的刺激作用又可增强LOX-1的表达，从而深化这一反应过程。除了对血小板的影响之外，PCSK9也有着潜在的通过调控LDLR与LRP1水平而调控凝血因子Ⅷ，进而影响凝血能力的作用，但目前尚无研究证明。

综上，PCSK9一方面可以直接激活血小板，另一方面也可导致血脂及炎症状态异常进而间接导致机体高凝状态，这均使得血小板功能在PCSK9水平升高情况下得到增强。这也提示，PCSK9 mAb除了在患者血脂控制方面的长期应用外，也具有在需要抗血小板乃至抗凝治疗的患者中与阿司匹林等传统药物联合使用的潜力，从而加强患者对抗血小板药物的反应性并改善预后。

4.增强肿瘤免疫抑制剂疗效：相较于PCSK9对脂代谢、炎症反应及凝血能力的调控，目前关于PCSK9对免疫功能的调控能力认知较少。2020年的一项研究表明，PCSK9基因缺失的肿瘤细胞注入小鼠体内后，其成瘤能力相较于野生型肿瘤细胞低，且这一过程与LDLR的表达无关。这一重要的新表型揭示了PCSK9与肿瘤免疫的重要联系。通过进一步的验证，该研究团队发现PCSK9除了结合于LDLR外，也可与主要组织相容性复合体Ⅰ结合并介导其在胞内溶酶体中降解的过程。因而敲除PCSK9或使用PCSK9 mAb中和，可以显著提高细胞表面主要组织相容性复合体Ⅰ的表达水平，提高T细胞对肿瘤的浸润能力，并增强以PD-1治疗为代表的免疫检查点阻断疗法的疗效。

PCSK9抑制剂的研发是罕见病研究在现代转化医学领域中的成功典范。作为一种靶向治疗药物，PCSK9抑制剂有广阔的应用潜力和发展前景。一方面，随着对PCSK9-LDLR作用机制的深入理解，开发的PCSK9抑制剂类药物种类不断地丰富和优化；另一方面，除LDLR外，PCSK9也与许多其他蛋白存在相互作用关系，包括CD36、主要组织相容性复合体Ⅰ等，这些相互作用也使得以PCSK9为靶点的治疗发挥除降脂以外的诸多获益。在药物优化和机制探索的共同发展下，PCSK9抑制剂类药物会在未来临床药物治疗中发挥更大作用。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突

参考文献：略

本文作者：封思琴  王一斐  陈沛沛  张志宇  张抒扬

转自：《中华心血管病杂志》2022年50卷03期